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Feb 28, 2024

Projeto racional de fermentação alcoólica visando carbono extracelular

npj Science of Food volume 7, Artigo número: 37 (2023) Citar este artigo 221 Acessos 3 Detalhes da Altmetric Metrics A criação de cepas de levedura para fermentação alcoólica industrial requer trabalho trabalhoso

npj Science of Food volume 7, número do artigo: 37 (2023) Citar este artigo

221 Acessos

3 Altmétrico

Detalhes das métricas

A criação de cepas de levedura para fermentação alcoólica industrial requer uma triagem trabalhosa devido à falta de estratégias de modificação in vivo. Aqui mostramos que o espessamento da parede celular específico da quiescência através da síntese de um componente principal, o 1,3-β-glucano, antagoniza criticamente a capacidade de fermentação celular, sequestrando as fontes de carbono citoplasmático disponíveis. Este estudo fornece insights sobre o controle glicolítico e relata um projeto de fermentação racional eficaz e confiável.

A compreensão atual da glicólise vem do estudo da fermentação alcoólica de leveduras1. O controle glicolítico é uma questão central no metabolismo celular2. O comportamento glicolítico robustamente otimizado da levedura, conhecido como efeito Crabtree3, dificulta o desenvolvimento de tecnologia de melhoramento para alterar a capacidade de fermentação alcoólica. A proteína fosfatase 2A (PP2A) complexada com a subunidade reguladora do tipo B55δ (Cdc55p) é a única responsável pela excelente atividade glicolítica das cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae4. Níveis elevados de glicose ativam o PP2AB55δ em leveduras e mamíferos. Em humanos, o metabolismo hepático da glicose desencadeia a desfosforilação da fosfofrutoquinase-2 / frutose-2,6-bifosfatase dependente de PP2AB55δ, promovendo a produção do principal ativador glicolítico, a frutose-2,6-bifosfato5,6. Em S. cerevisiae, entretanto, seu papel no controle glicolítico permanece questionável7. Portanto, o mecanismo subjacente à fermentação alcoólica de levedura mediada por PP2AB55δ permanece desconhecido.

RNA-seq de células cdc55Δ de S. cerevisiae, especificamente defeituosas na função PP2AB55δ, ao entrar na quiescência celular no estágio inicial de fermentação revelou regulação positiva de genes responsivos ao estresse sob o controle de fatores de transcrição redundantes, como Msn2p, Msn4p (Msn2/ 4p) e Gis1p, funcionalmente associado ao FoxO8 de mamífero (Figura 1 Complementar, Tabelas Suplementares 1 e 2). A perda de Cdc55p levou a um aumento significativo na expressão destes genes de maneira dependente de Msn2 / 4p (Fig. 1a, b, Figura 2 suplementar). Isto foi inesperado porque a perda de Cdc55p reduz a expressão aguda responsiva ao estresse de genes idênticos em células em proliferação exponencial (Figura 3 suplementar)9. Portanto, PP2AB55δ exibe efeitos opostos na ativação de Msn2/4p nas fases de quiescência e proliferação (Figura 4 suplementar). A deleção dos genes MSN2/4 no fundo cdc55Δ recuperou quase completamente o fenótipo de fermentação pobre (Fig. 1c e Figura 5 suplementar), sugerindo que Msn2/4p é um importante inibidor glicolítico.

a Perda de PP2AB55δ (cdc55Δ) aumenta a expressão de genes direcionados a Msn2/4p no estágio inicial da fermentação. O eixo y representou os níveis de expressão relativos em comparação com as amostras de 6 horas do tipo selvagem. Os valores são as médias e os desvios padrão de três experimentos independentes. b cdc55Δ aumenta a localização nuclear de Msn2p-GFP na fase inicial da fermentação. Barras, 5 μm. c A baixa capacidade de fermentação das células cdc55Δ depende principalmente do Msn2/4p. WT, tipo selvagem. (d, e) cdc55Δ aumenta a síntese de 1,3-β-glucano dependente de Msn2 / 4p. d Níveis celulares de 1,3-β-glucano 24 horas após a inoculação. Os valores são as médias e os desvios padrão de três experimentos independentes. e Observação TEM de células de levedura 24 horas após a inoculação. Homem, manoproteínas; βGlc, camada de β-glucano; PM, membrana plasmática; Cit, citoplasma. Barras, 100 nm. f Modelo hipotético de sequestro de carbono extracelular via PP2AB55δ e Msn2/4p. Glc glicose, Glc-6-P glicose-6-fosfato, Glc-1-P glicose-1-fosfato, UDPG UDP-glicose, transportador de hexose HXT, GS 1,3-β-glucano sintase. Os asteriscos denotam valores estatisticamente diferentes do WT, conforme determinado pelo teste t de Student, p < 0,05.

Msn2/4p regula positivamente genes da via de síntese de UDP-glicose, que se ramifica diretamente da glicólise via glicose-6-fosfato10. A UDP-glicose é usada principalmente como substrato para a biossíntese de trealose, glicogênio e 1,3-β-glucano em S. cerevisiae. A trealose citoplasmática e os shunts de glicogênio são ativados transitoriamente após estresse agudo ou entrada de quiescência; portanto, a deleção dos genes de síntese de trealose e glicogênio não contribui positivamente para a fermentação alcoólica11. Em contraste, o 1,3-β-glucano acumula-se durante o período de fermentação e a sua degradação extracelular não reabastece imediatamente a glicólise. Assim, a síntese de 1,3-β-glucano em células quiescentes pode estar envolvida no controle metabólico através da descarga de fontes de carbono fermentáveis ​​no espaço extracelular. A quantificação da parede celular (Fig. 1d) e a microscopia eletrônica de transmissão (Fig. 1e) revelaram espessamento acentuado de 1,3-β-glucano na fermentação de células cdc55Δ e sua completa ausência em células cdc55Δ msn2 / 4Δ, inversamente correlacionadas com as taxas de fermentação. Portanto, a síntese hiperativada de 1,3-β-glucano é responsável pelo fenótipo de fermentação pobre das células cdc55Δ.